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技術與平臺

范例分析:在大腸桿菌中表達可用作結構分析的CYP-X蛋白

背景

客戶要求從基因序列開始生產CYP-X蛋白并用純化后的蛋白長晶體來做結構分析。

挑戰

  • 該蛋白表達水平非常低(小于0.5 mg/L)。
  • 該蛋白的溶解度很低。
  • 該蛋白目前的狀態不利于結晶化。

解決方案/結果

  • 藥明生物嘗試了不同的大腸桿菌菌株以及多種表達載體組合來優化該蛋白的表達,同時還在培養基里加入了微量元素來提高產量。
  • 項目組在純化過程中使用高鹽裂解緩沖液,并使用了弱陽離子柱來優化純化工藝。
  • 通過這些努力,項目組成功使該蛋白的表達從小于0.5mg/L提高到了15mg/L,并且用表達出的蛋白獲得了高質量的衍射晶體,成功運用在了結構分析中。

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范例分析:純度可超過95%的IgM生產

背景

客戶要求生產95%以上純度的IgM (通過SDS-PAGE和HPLC檢測)。

挑戰

  • 由于該蛋白分子量很大,導致它與原有的純化填料結合力很低而且流速很慢。
  • 該蛋白的低溶解度和極端PH下容易變性的特點也決定了它無法使用傳統的親和柱純化。

解決方案/結果

  • 藥明生物的項目組在查閱了大量的文獻后決定采用一種新方法來進行對流傳質。
  • 同時結合在大分子蛋白生產上積累的豐富經驗,項目組提出了一種新的三步柱純化方案。
  • 最終成功實現了在短短六周內就交付了200mg完整表征的純度97%的IgM。

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范例分析:用桿狀病毒感染的昆蟲細胞表達系統來生產激酶-Y

背景

客戶要求生產高純度的激酶-Y。

挑戰

  • 該蛋白在大腸桿菌里是作為包涵體表達的。
  • 客戶曾在他們自己的昆蟲細胞里嘗試過表達,結果產量非常低。
  • 由于舊有的純化方法需要多個柱子,純化時間的過長也導致了純度和蛋白降解。

解決方案/結果

  • 藥明生物項目組首先把桿狀病毒的滴度成功提高到了108 pfu/ml。
  • 并且通過不同的MOI和時間點的嘗試進一步優化了表達量。
  • 繼而通過分子篩和親和柱優化了純化工藝。
  • ? 最終項目組成功從1.6L的培養體系中交付了25mg純度高于95%的激酶-K。

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范例分析:采用不同的抗體篩選平臺獲得種型特異性抗體

背景

  • 靶標蛋白有兩個亞型,兩個亞型之間區別很小。
  • 我們已經找到一些針對亞型1的功能抗體,并且從雜交瘤技術中獲得了很多同時結合亞型1和亞型2的功能抗體。

挑戰

經過多次免疫,始終沒有得到特異性針對亞型2的功能抗體。

解決方案/結果

通過對我們自主構建的人天然噬菌體庫進行篩選,我們可以只用一次戰役就獲得亞型2特異性的功能抗體,總結見右圖。

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范例分析:從藥明生物自主構建的全人天然抗體噬菌體庫中篩選抗體藥物

背景

用藥明生物自己建立的全人天然抗體庫中獲得特異性識別抗原1的兩個剪接異變體1a和1b的抗體。

挑戰

  • 靶標抗原有兩個剪接體(1a和1b),之間區別大于20個氨基酸。
  • 雜交瘤技術不能得到選擇性識別1b抗原的抗體。

解決方案/結果

用抗原1b作為篩選目標,同時加入抗原1a作為競爭劑,從人天然抗體噬菌體庫中篩選抗體,用單克隆抗體噬菌體ELISA檢測第二輪和第三輪的產物, 尋找特異性結合的抗體噬菌體。篩選中我們發現,第三輪的產物中抗原1b特異性的抗體獲得富集,而抗原1a和1b的交叉結合抗體相應減少。序列分析第三輪的陽性克隆,得到6個不同序列的抗體株,其中2個和細胞表面表達的抗原1b有非常強的結合 (數據未顯示)。

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范例分析: 用親和力成熟獲得Kd值在皮摩爾級別的抗體

背景

要求對客戶的鼠單克隆抗體進行親和力成熟并人源化。

挑戰

母本抗體的親和力約1nM,需要提高親和力到幾十pM,以達到與對照抗體親和力接近或者更高。

解決方案/結果

  • 我們利用兩個方法提高抗體親和力:

1. 吝嗇突變(Parsimonious mutagenesis)重鏈的CDR3區
2.對輕重鏈進行隨機突變

  • 吝嗇突變(Parsimonious mutagenesis) 將親和力提高10倍
  • 隨后進行隨機突變,得到5個親和力提高的克隆
  • 最后選擇了一個克隆,具有皮摩爾級別的親和力,優于對照抗體。

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